技術領域
本發明涉及醫藥技術領域，是一種可用於治療缺血再灌注損傷的含氫注射液。
背景技術
缺血是臨床疾病中最常見原因之一，缺血再灌注損傷是腦缺血等最重要病理生理過程，缺血性疾病通常可在早期採用溶栓和抗自由基損傷等技術來防治。氫氣目前僅作為保健品使用，尚未應用於臨床，如日本和我國有學者用呼吸氫氣治療腦、肝、心缺血再灌注損傷，日本有公司用含有氫氣的飲用水作為美容保健品，至今未見有關採用含氫注射液防治缺血再灌注損傷的相關報導。
發明內容
本發明提供一種含氫注射液，用於防治腦缺血等導致的組織損傷和器官功能障礙。其為一種含有濃度為
製備方法如下：
1.脫氣處理
生理鹽水、糖鹽水或碳酸氫鈉注射液等醫用注射液軟包裝袋，如含氫生理鹽水等，用低壓艙0.4~0.8個絕對壓大氣壓減壓處理 2~24小時，再在常壓下放置 4~12小時使超飽和部分的氣體充分析出，將析出的氣體抽除；
2.低溫預處理
將脫氣處理後的注射液軟包裝袋置於 2~10℃充分冷卻，以 便注入氫氣後增加對氫氣的溶解度；
3.注入純氫氣
從低溫處理後的注射液軟包裝抽取總體積 5～ 15%的生理鹽水，注入與抽出液體體積相同的該溫度下的純氫氣（常壓）；
4.加壓助溶
將注入氫氣後的注射液軟包裝放入加壓艙， 1~5℃下 持續加壓 12~24小時，使氫氣充分溶入註射液，減壓後取出置 0~5℃保存 備用，穩定 24小時後即可使用。按本方法製備的含氫注射液經中國科學院大連化學物理研究所測氫氣濃度為 1.6-2.0%。
本發明注射液經動物實驗，對大鼠腦缺血再灌注損傷模型，能明顯減少腦梗死體積、減輕組織損傷、減少神經組織細胞凋亡數量、降低海馬和皮層凋亡酶活性，因此可用於治療腦缺血再灌注損傷。另外在心肌缺血再灌注、腎臟缺血再灌注和肝臟缺血再灌注損傷模型中觀察到類似效果。因此本發明含氫注射液可用作治療缺血再灌注損傷的藥物。
附圖說明
圖 1 為大鼠腦缺血再灌注後梗死體積的比較圖譜。
圖 2 為大鼠腦缺血再灌注後尼氏染色圖譜。
圖 3 為大鼠腦缺血再灌注後細胞凋亡圖譜。
圖 4為大鼠腦缺血再灌注後皮層和海馬凋亡酶活性檢測圖譜。
具體實施方式
現結合附圖和實施例對本發明作詳細描述。
實施例 1. 製備含氫生理鹽水注射液
1.脫氣處理
生理鹽水注射液 500 mL，用低壓艙 0.4個絕對壓大氣壓下減壓處理 2小時，取出後常壓下放置 4小時，將析出氣體用注射器抽除；
2.低溫預處理
將上述脫氣處理後的注射液軟包裝袋置 2℃常壓下 2個小時充分冷卻；
3.注射純氫氣
從上述低溫處理後的軟包裝抽取 50 mL的生理鹽水，注入 2℃常壓下 50 mL的純氫氣（上海基量標準氣體有限公司氫標準氣產品，下同）；
4.加壓助溶
將注入氫氣後的注射液軟包裝放入加壓艙， 5℃下持續加壓 12小時，使氫氣充分溶入註射液，減壓後取出置 5℃常壓下保存 24小時後即可使用。
實施例 2. 製備含氫葡萄糖鹽水注射液
注射液為葡萄糖鹽水注射液、加壓助溶後置 4℃常壓保存備用，其餘同實施例1。
實施例 3. 製備含氫生理鹽水注射液
脫氣處理時，注射液軟包裝袋置於低壓艙，在絕對壓 0.5個大氣壓減壓處理14小時，取出後常壓下放置 5小時；低溫預處理時，將脫氣處理後的注射液軟包裝袋置 4℃冰箱冷卻 56小時；加壓助溶時，將注入 氫氣後的注射液軟包裝袋 4℃下持續加壓 15小時；取出後置 4℃常壓保存備用，其餘同 實施例 1。
動物實驗
實驗動物： SD雄性大鼠，體重 220~250克， 購買自 第二軍醫大學實驗動物中心。
取大鼠 65只，雄性，隨機分成 5組：正常對照組、陰性對照組、實施例 1製備的注射液低、中、高劑量治療組，每組 13只。除正常對照組外，其餘各組大鼠先製備成腦缺血再灌注損傷模型，再灌注後 10 min，分別腹腔注射生理鹽水和本發明實施例 1製備的注射液。其中，本發明注射液低劑量組按體重註射 0.3 ml/100g，本發明注射液中劑量組注射 0.6 ml/100g，本發明注射液高劑量組注射 0.9 ml/100g，陰性對照組和正常對照組各注射生理鹽水 0.6 ml/100g。
大鼠腦缺血再灌注損傷模型製備方法為：
1. 參照 Longa 、 Kuge 等 （詳見參考文獻： Kuge Y, Minematsu K, Yamaguchi T, et al. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1995,26:1655-58） 報導的方法，採用頸外動脈插入線栓法造模。 SD 大鼠用 笑氣 / 氧（ 70:30）加 1% 七氟烷麻醉 ，仰臥固定，頸正中切口，鈍性分離暴露右側頸總動脈、頸外動脈與頸內動脈，結紮頸外動脈遠端，游離其主幹備用。尼龍線長 40 mm，直徑 0.20~0.23 mm，一端約 0.5 cm長度上均勻塗佈聚胺酯輕漆，使其頭端成一光滑的錐型，頭端直徑小於 0.25 mm，從右側頸外動脈入口，至右頸總動脈後，轉向右頸內動脈入顱推進 17~19 mm，微遇阻力時停止，完成一側大腦中動脈的阻塞。再灌注時緩慢地輕拉線栓使其頭端回到頸外動脈內，可實現大腦中動脈再灌注。本實驗採用的動物模型均為缺血 90分鐘後再灌注。
上述各組大鼠在腹腔注射 24小時後處死，分別取腦組織進行 TTC、 HE、尼氏、細胞凋亡染色，並提取海馬和皮層腦區測定凋亡酶活性。實驗結果如下：
1．觀察對大鼠腦缺血再灌注後腦梗死體積的影響：
取各組動物腦組織，進行 TTC染色， TTC染色是檢測組織缺血梗死體積的經典方法，染色後缺血區顯示為白色，正常組織為紅色。結果見圖 1，圖 1中， A.正常對照組； B. 陰性對照組； C. 本發明注射液中劑量治療組。圖 1顯示，陰性對照組梗死範圍分佈在缺血側皮層、海馬和尾核，本發明中劑量治療組梗死範圍僅出現在缺血側部分皮層，表明本發明注射液可明顯減少腦梗死體積。
2．觀察對大鼠腦缺血再灌注後 24小時腦皮層與海馬神經元數量的影響：取各組動物腦組織，石蠟固定並切片，採用經典的尼氏染色（詳見參考文獻： Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C, Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156），結果見圖 2。由圖 2可見：與正常對照組相比，陰性對照組腦皮層與海馬神經元明顯減少，說明腦缺血再灌注後腦皮層與海馬神經元出現明顯損傷，本發明注射液低、中、高劑量對腦缺血再灌注後腦皮層與海馬神經元均有改善，其中以中劑量 0.6 ml/100g組作用最明顯，神經元細胞數量和組織結構均接近正常對照組。結果表明，本發明注射液可減輕大鼠腦缺血再灌注後神經元損傷。
3. 觀察對大鼠腦缺血再灌注後 24小時腦皮層與海馬細胞凋亡數量的影響：取各組動物腦組織，石蠟固定並切片，採用 Tunel染色（詳見參考文獻： Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C, Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156），結果見圖 3，圖 3中分組同圖 2。由圖 3可見：本發明注射液低、中、高劑量對腦缺血再灌注後腦皮層與海馬細胞凋亡數量減少，其中以中劑量組 0.6 ml/100g作用最明顯，接近於正常對照組水平。結果表明，本發明注射液可減輕大鼠腦缺血再灌注後細胞凋亡。
4．觀察對大鼠腦缺血再灌注後 24小時腦皮層與海馬凋亡酶活性的影響：取各組動物新鮮腦組織，採用熒光酶活性檢測（詳見參考文獻： Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C, Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156），結果見圖 4。由圖 4可見：本發明注射液低、中、高劑量對腦缺血再灌注後腦皮層與海馬凋亡酶活性明顯減小，其中以中劑量組 0.6 ml/100g作用最明顯，接近於正常對照組水平。結果表明，本發明注射液可降低大鼠腦缺血再灌注後凋亡酶活性。
上述實驗結果表明，本發明注射液可減少大鼠局灶性腦缺血後腦梗死體積、保護神經細胞損傷、減少細胞凋亡數量、降低皮層和海馬凋亡酶活性，在心肌缺血再灌注、腎臟缺血再灌注和肝臟缺血再灌注損傷模型中觀察到類似效果。所以本發明可用於治療腦、心、腎等重要器官缺血再灌注損傷。
10年前德國關於含氫氣藥物的專利：德國
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