低氘氫水實驗室

氫氣器官保護液可保護腎臟冷缺血再灌注損傷

已有 226 次閱讀 2012-6-12 14:35 |個人分類:氫氣細胞學研究|系統分類:論文交流|關鍵字:腎臟 的 器官移植 style 影響

腎臟器官移植是終末期腎臟疾病的最理想治療方法。但是腎臟器官移植過程中無法避免缺血再灌注損傷，而且在移植腎臟後期和長期功能改變中均發揮重要影響。另外，來自心臟死亡供體的器官要面臨冷缺血時間危及移植後腎臟存活的潛在危險因素。冷缺血時間12小時以內是移植腎臟存活的關鍵，但是大多數心臟死亡供體的器官都超過這個冷缺血時間。器官缺血時能量物質供應和需求不平衡導致組織缺氧和微血管功能異常，再灌注進一步增強固有/適應性免疫反應和細胞死亡過程。因此，優化體外器官保護手段能減少缺血再灌注損傷、提高移植器官存活率和長期治療效果。

缺血再灌注引起腎臟器官損傷的主要因素之一是毒性氧自由基的產生，毒性氧自由基過度產生可以導致 DNA 受損、蛋白氧化和硝基化、脂質過氧化、細胞凋亡等細胞損傷。最近Ohsawa等證明氫氣通過減少細胞毒性氧自由基對腦缺血再灌注損傷產生保護作用。 Shingu等證明靜脈注射氫氣飽和生理鹽水可減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。早期的研究發現，添加氣體可以改進器官保護液功能。 Nakao等證明一氧化碳溶解在威斯康辛大學溶液中可保護大鼠心臟冷缺血再灌注損傷。本研究假設威斯康辛大學溶液中溶解氫氣可以保護腎臟冷缺血再灌注損傷。

研究結果

1、製備氫氣器官保護液

這個研究提供了一種新型的氫氣溶解方法（技術模擬圖(Fig. 1A) MiZ Co., Ltd., Kanagawa, Japan，曾有人使用這個技術製備給人注射用的氫氣飽和生理鹽水）。他們用灌滿器官保護液的離心管浸泡在氫氣飽和溶液中，溫度保持在5度，氫氣從氫氣飽和溶液（1.60 mg/L）通過管壁擴散到灌滿器官保護液，48小時後保護液中氫氣濃度可以達到1.32 mg/L(Fig. 1B)。然後把腎臟放入離心管，隨後將該離心管繼續浸泡在5度氫氣飽和溶液中24小時，氫氣濃度仍可以達到1.39 mg/L（和放腎臟前1.32 mg/L無統計學差異(Fig. 1C)）。在溶解氫氣的同時，不影響器官保護液內的氧氣濃度（9.6 ±0.3vs. 9.5 ±0.4 mg/L，注意：這一點特別重要，如果採用氫氣加壓的技術，氧氣的濃度必然顯著下降）。

2、移植腎臟存活和腎臟功能改變

三組動物：直接移植（無冷缺血）、UW（無氫氣保護液）冷缺血組和HRUW（氫氣保護液）冷缺血組。不同冷缺血時間：24小時、36小時和48小時。存活100天結果發現，無冷缺血組動物腎臟全部存活1， 24小時冷缺血組UW和HRUW無統計學區別（78.6% vs. 100%,）。36小時冷缺血組HRUW存活66.7%，遠超過UW的20.0%。48小時冷缺血組UW和HRUW無統計學區別。（這個設計非常值得學習，我們一般在進行設計的時候，往往是希望所有的指標整齊劃一，但在實際情況下，由於損傷程度不同，損傷太少的，看不到死亡率的區別，死亡太大的，看不到治療效果的差別，死亡率有明顯區別，機制研究帶來災難。作者進行三種不同程度的區分，只發現36小死亡率的統計學改變，不影響進行後續的深入研究，精彩的在後面）。

儘管 24 小時沒有死亡率的統計學差異（其實 78.6% vs. 100%, 也不錯，只要增加動物樣本數量，相信同樣可以有統計學差異的），作者對這一組動物進行了腎臟功能的檢測，他們是在腎臟移植後 90 天進行的檢測。結果發現。肌苷、肌苷清除率和24小時蛋白尿等指標HRUW都顯著優於UW 。說明氫氣飽和保護液對長期的移植後腎臟功能影響是顯著的（這個處理非常聰明）。

3、氫氣保護液可以減少移植腎小管損傷和間質纖維化

前面的研究提示氫氣保護液可以對 24 小時冷缺血後的移植腎長期功能產生明顯的保護。隨後他們對移植腎100天后的組織形態學進行了檢測，主要觀察到腎小管萎縮、擴張、刷狀緣丟失、炎症細胞浸潤和管型形成等。和普通的保護液相比，氫氣保護液可以顯著減少腎小管上述損傷（損傷評分下降）。間質纖維化用馬森三色染色定量，結果發現氫氣保護液可以顯著改善間質纖維化。

4、氫氣保護液可以減少氧化損傷（特別注意動物分組和取材的時間點）

氫氣生物學效應研究總無法排除氧化損傷的效應觀察。隨後作者對冷缺血36小時移植後3小時 的移植腎臟組織 MDA 和血清中 8 羥基鳥嘌呤，結果發現移植腎臟組織 MDA 在氫氣保護液組明顯低於普通保護液組 53.8 [14.3] vs. 37.7 [7.3] KM/g 。但血清中8羥基鳥嘌呤無顯著性改變0.34[0.08] vs 0.29 [0.03]mg/L,P=0.524。

5、氫氣保護液對腎小管細胞碉亡和間質巨噬細胞浸潤的影響

因為氫氣保護液可降低氧化損傷，隨後作者對腎小管細胞碉亡和間質巨噬細胞浸潤。這個實驗是冷缺血36小時，移植後24小時取材（注意：這樣的設計決定於觀察指標細胞碉亡巨噬細胞浸潤）。Tunel和ED-1免疫組織化學分別作為細胞碉亡和巨噬細胞浸潤的觀察指標）。研究結果顯示，氫氣飽和保護液的效果超過普通的保護液。（這個研究可說明為什麼氫氣可以增加存活率是因為減少了早期24小時的細胞碉亡和炎症反應。當然，Tunel也不是單顯示細胞碉亡，這裡無法排除細胞死亡的情況，甚至死亡更多更重要。）

6、基因表達和蛋白水準的研究

（為了使研究達到分子水準，總需要這樣的點綴。）這個內容取材同實驗5，也是冷缺血36小時，移植手術後24 小時取腎臟組織。定量PCR結果顯示，幹擾素g、白細胞介素6 、腫瘤壞死因數 a 、血紅素加氧酶 1 的 mRNA 沒有改變（儘管顯著高於正常組織）。不過趨化因數(C-C 基元 )配體2、誘導型一氧化氮合酶的mRNA都顯著下降，趨於正常。誘導型一氧化氮合酶的Western Blot結果符合mRNA的改變。

討論

1、氫氣可用於潛水作業，因此相當安全。

儘管容易爆炸，但濃度只要不超過 4.7% 就不燃燒，自從 Ohsawa 發現氫氣可以中和自由基治療腦缺血後，氫氣治療各類疾病成為研究熱點。

2、氫氣可以呼吸，已經證明呼吸氫氣可治療許多疾病。但呼吸的方法不方便日常使用，難以連續使用。喝氫氣飽和水是個辦法，研究也證明效果不凡。但喝水不容易確定劑量，給研究帶來一定麻煩。於是就有人開展注射氫氣鹽水，效果確實不錯。氫氣溶解的方法有通過加壓處理、通氣泡溶解的方法。我們的研究提供了一個新的技術，可以不影響包裝內成分的前提下製備出氫氣飽和溶液。這個方法作氫氣水牛，他們稱為「非破壞性溶解氫氣技術」。因為不需要打開包裝，可對目前使用的臨床製劑進行加氫氣處理，不會使處理的溶液發生成分或微生物污染，就可以進入臨床使用（廣告？）。

3 、本研究首先評價了氫氣保護液可更加有效地保護體外保護器官。其作用可能是具有抗氧化作用。其中特別注意的是可降低iNos這樣可能具有抗硝基化的作用。

基因蛋白表達的結果顯示該保護液體具有抗早期炎症的作用，雖然對一些因數的改變沒有明顯改善，但對巨噬細胞相關的炎症因數改變顯著，這正好符合巨噬細胞浸潤的結果。

研究中發現儘管器官移植後 HO-1 mRNA 增加，但氫氣沒有使之下降，說明這個模型中的效應和 HO-1 沒有關系。（不過只測定mRNA，沒有蛋白和活性的分析，這個結論不夠嚴格。）

總之，這個研究發現，將氫氣溶解在器官保護液中，可以提高保護效果，主要是通過減少氧化損傷、降低炎症反應，減少早期細胞壞死和間質纖維化，從而對移植腎臟的產生明顯的長期保護效果。

Hydrogen-Rich University of Wisconsin Solution Attenuates Renal Cold Ischemia-Re.pdf

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